عمس العمل ترومبوسيت جوجه هاي گوشتي به ليپوپلي ساكاريد
واکنش جوجه های گوشتی
 
واكنش ترومبوسيت جوجه هاي گوشتي به ليپوپلي ساكاريد
 
خلاصه: تاثير ليپوپلي ساكاريد (LPS) بر آشكارسازي ياخته جنبي proinflammatory ، (IL)-1β،IL-6،IL12 در ترومبوسيت جوجه‌هاي گوشتي مورد ارزيابي قرار گرفت. در 4 هفتگي، نمونه‌هاي خون جمع‌آوري شد، و ترومبوسيت‌هاي جداسازي‌شده به مدت 1 ساعت در LPS خوابانده شدند. اسيد ريبونوكلوئيك از سلول‌ها خارج شد تا آشكارسازي ياخته جنبي proinflammatory با استفاده از نسخه‌برداري معكوس بلادرنگ PCR مورد آزمايش قرار گيرد. كشف شد كه آشكارسازي IL-1β،IL-6،IL-12 در ترومبوسيت‌ها تحت تاثير رژيم‌هاي غذايي حاوي كورتيكوسترون و ويتامين C قرار نمي‌گيرند. به هر حال، در معرض LPS قرار گرفتن باعث افزايش اين سيتوكين‌ها نشد. اين حقيقت كه ترومبوسيت‌ها بسيار زياد هستند و مي‌توانند توسط LPS تحريك شوند باعث مي‌شود كه اولين سلول‌هاي موثر در ميزبان طبيعي مستحكم در برابر آلودگي‌هاي باكتريايي جوجه ها شوند. 
   
    مقدمه
   ترومبوسيت‌هاي جوجه‌ها، ليكوسيت‌هاي هسته‌دار خون هستند كه نشان‌دهنده فراوان‌ترين گونه‌هاي سلول‌هاي سفيد در خون جوجه مي‌باشند. از آنجايي كه مغز استخوان جوجه داراي مگاكاريوسيت نمي‌باشد، ترومبوسيت از سلول‌هاي تك‌هسته‌اي قبلي به وجود مي‌آيد. ترومبوسيت‌ها در عملكرد در برابر پلاكت‌هاي پستانداران همولوگ هستند. پلاكت‌ها كوچك‌ترين سلول‌هاي خوني هستند كه تنها باقي مانده سيتوپلاسم مگاكاريوسيت مي‌باشند. پلاكت‌ها به دليل نقش آنها در مكانيسم دفاع ميزبان طبيعي در تحقيقات ايمن‌شناختي سال‌هاي اخير موضوعات مرموزي بوده‌اند. پلاكت‌ها بيشتر به دليل پروسه هموستاز و مبادرت به ترميم زخم شناخته شده‌اند. در كنار نقش آنها در هموستاز و ايجاد ترومبوس (لخته خون) بعد از صدمه آندوتليال، پلاكت‌ها نيز در فرآيندهاي التهاب و ترميم بافت شركت مي‌كنند. پلاكت‌ها مولكول‌هاي فعال زيستي فراواني از قبيل عامل شيميوتاكسي را براي تمام سلول‌ها، پروتئين‌هاي كاتيوني، هيستامين، سروتونين، پروستاگلاندين E2، و پروستاگلاندين D2 را آزاد مي‌كنند. 
    ترومبوسيت‌هاي جوجه‌ها در اين تحقيق مورد استفاده قرار گرفته است تا آشكارسازي ژن سيتوكين‌هاي proinflammatory را تجزيه كنيم. جوجه‌هاي گوشتي تجاري مي‌توانند در معرض تنش‌زاهاي مختلف قرار گيرند و در محيط‌هايي كه ميكروارگانيسم‌هاي هوايي و اجزاي ميكروبي سلامتي جوجه‌ها را به خطر مي‌اندازند، رشد كنند. بنابراين، ترومبوسيت‌هاي جداشده با LPS كشت شدند تا قابليت واكنش جوجه‌هاي گوشتي به اين اجزاي ميكروبي را از طريق اين گونه بي‌مانند سلول تعيين كنند. 
    
    مواد و روش‌ها
    54 جوجه گوشتي كه در اين تحقيق مورد استفاده قرار گرفتند از جوجه‌كشي محلي گرفته شده بودند و تا 2 هفتگي رژيم استارتر دريافت كردند. براي آزمايش 2 تكرار ، 18 و 36 جوجه به طور اتفاقي به 3 گروه منصوب شدند كه از 2 هفتگي تا 4 هفتگي رژيم متفاوتي را دريافت مي‌كردند و دانشگاه مورگان، كلمسون و كاروليناي جنوبي نگهداري شدند. گروه‌هاي رژيمي، رژيم كنترل بودند (رژيم دانه استاندارد)، رژيم كنترل با 30 ميلي گرم/كيلوگرم كورتيكوسترون براي تحريك تنش اكسايشي، و رژيم كنترل با 30 ميلي گرم/ كيلوگرم كورتيكوسترون به اضافه 500 ميلي گرم/ كيلوگرم ويتامين C. 
    نمونه‌هاي خون از رگ بال به همراه 10 درصد EDTA به عنوان ماده ضدانعقاد خون درون سرنگ‌ها جمع‌آوري شدند تا ترومبوسيت جداسازي شود. خون جمع‌آوري‌شده بر روي يخ انباشته شد تا به آزمايشگاه منتقل شود. پروتوكل جداسازي ترومبوسيت مورد استفاده در اينجا مدل تغيير يافته پروتكل مورد استفاده توسط هوريوشي و همكارانش بود. نمونه‌هاي خون با محلول نمك فاقد CA+2 و Mg+2 رقيق شدند. نمونه‌هاي رقيق‌شده خون بر روي واسطه جداسازي لنفوسيت طبقه‌بندي و در 1700× g به مدت 30 دقيقه در دماي اتاق سانتريفيوژ شد. باندهاي حاوي ترومبوسيت جمع‌آوري شدند، دو بار شسته شدند ، مجددا در محلول نمك متعادل هنك معلق شدند. رنگ آبي تريپن براي كيفيت‌يابي تعداد سلول‌هاي زنده در هماسيتومتر (دستگاه شمارش گويچه‌هاي خون) مورد استفاده قرار مي‌گيرد. غلظت سلول در محيط كشت شيشه‌اي در حدود 1×107ميلي‌ليتر مي‌باشد. ترومبوسيت‌ها در 10 ميكروگرم از مينه سوتا سالمونلاي خالص LPS بر روي سكوي نوسان‌دار در دماي 40 درجه سانتي‌گراد خوابانده شدند.
    بعد از تحريك ترومبوسيت‌ها، سلول‌ها در 5000×g به مدت 2 دقيقه تا پلاكت شدن سانتريفيوژ شدند. پلاكت‌ها در طول شب در 100 ميكروليتر از RNA و در دماي 4 درجه سانتي‌گراد ذخيره شدند. بعد از 24 ساعت، سلول‌ها مجددا سانتريفيوژ شدند تا مواد شناور آنها گرفته شود و در دماي 20- درجه سانتي‌گراد براي استفاده‌هاي بعدي ذخيره شدند. كيت RNeasy مورد استفاده قرار گرفت، و از پروتكل‌سازنده پيروي شد تا كل RNA را از اين نمونه‌ها جدا كنند و توسط درمان DNase، هر DNA ژني را خارج كردند. 
    نسخه‌برداري معكوس بلادرنگ PCR (RT-PCR ) با استفاده از كيت Quanti Tech SYBR Green RT-PCR انجام شد. آماده‌سازهاي مورد استفاده در افزايش دهيدروژناز گليسرالدئيد 3- فسفات از تكنولوژي‌هاي پيوسته DNA به دست مي‌آيد. تركيب RT-PCR شامل 25/0 ميكروليتر از مخلوط QuantiTect RT، 5/12 ميكروليتر از مخلوط QuantiTect SYBR Green RT-PCR ×2 ، 5/0 ميكروليتر از هر آماده‌ساز خاص، 10 ميكروليتر از RNA الگو و 25/1 ميكروليتر از آب بدون RNase مي‌باشد تا حجم واكنش نهايي 25 ميكروليتر به دست آيد. سابقه نوسان مورد استفاده در تمام واكنش‌ها، 1 چرخه 50 درجه سانتي‌گرادي به مدت 30 دقيقه ، 95 درجه سانتي‌گراد به مدت 15 دقيقه، و 40 چرخه 94 درجه سانتي‌گرادي به مدت 15 ثانيه ، 57 درجه سانتي‌گراد به مدت 20 ثانيه و 72 درجه سانتي‌گراد به مدت 20 ثانيه مي‌باشد. كيفيت‌ساز نسبي سطوح mRNA با استفاده از محاسبه تغيير گروه در طول Pfaffl مي‌باشد. 
    آزمايش كارخانه‌اي با استفاده از طرح كرت‌هاي شكافته شده در مورد جوجه‌هاي گوشتي انجام شد تا تكرارها را براي هر يك از 3 رژيم در آزمايش تكرار شده، مشخص كند. نمونه‌هاي خون جمع‌آوري‌شده از هر جوجه گوشتي به 2 قسمت تقسيم شد كه يك قسمت به عنوان كنترل عمل مي‌كرد و قسمت ديگر توسط LPS تحريك مي‌شد. تجزيه واريانس‌ها توسط روش GLM انجام شد و فرضيه‌هاي آزمايش با استفاده از α=0.05 اجرا شد. 
    
    نتايج و بحث‌ها
    رژيم‌ها بر آشكارسازي سيتوكين‌هاي پرالتهاب تاثير نمي‌گذارد، اما تحريك LPS باعث افزايش سطح آشكارسازي در مقايسه با ترومبوسيت‌هاي كنترل عمل نيامده شد. (شكل 1). از اين شكل مشخص است كه آشكارسازي نسبي تكرار در مورد IL-1β ، IL-6، و IL-12 افزايش مي‌يابد. بيشترين آشكارسازي مشاهده‌شده در تغيير تكرار نسبي IL-6 بود. Interleukin-1β داراي آشكارسازي واضح بود اما درجات تغيير پائين‌تري نسبت به IL-6 داشت. Interleukin-12 در مقايسه با 2 سيتوكين پرالتهاب ديگر به طور متوسط تحريك شد، اما تغيير تكرار آن نيز مشخص بود. 
    ليپوپلي ساكاريد بر عملكرد سلول تاثير مي‌گذارد و آشكارسازي ژن را در مونوسيت، ماكروفاژ و هتروفيل جوجه القاء مي‌كند. در حقيقت، ما در اين تحقيق نشان داده‌ايم كه LPS باعث القاي آشكارسازي سيتوكين‌هاي التهاب‌دار IL-1β، IL-6، IL-12 در ترومبوسيت‌هاي شبيه به هتروفيل مي‌شود، سلول‌هاي موثر اوليه ميزبان فطري با آلودگي باكتريايي در ماكيان‌ها مقابله مي‌كند. هتروفيل‌ها معادل مرغي نوتروفيل هستند و به عنوان فاگوسيت متخصص عمل مي‌كنند تا به تنظيم دفاع ميزبان فطري كمك كنند. هتروفيل جوجه به طور اساسي داراي گيرنده Toll-like (TLR ) 10/6/1، گونه 1 TLR2، گونه 2 TLR2، TLR3، TLR4، TLR5 و TLR7 مي‌باشند. آزمايشگاه ما اخيرا نشان داده است كه ترومبوسيت، TLR2، TLR3، TLR4، TLR5 و TLR7 آشكار مي‌سازد. بنابراين، تاثير LPS مشاهده شده بر روي ترومبوسيت جوجه‌هاي گوشتي داراي نقش مهمي در هموستاز پلاكت‌هاي پستانداران مي‌باشد. همچنين نشان داده شده است كه ترومبوسيتها، پروتئين‌هاي آنتي هپارين ترشح مي‌كنند. اما تا اين زمان، هيچ تحقيقي در مورد ترومبوسيت‌هايي كه داراي توانايي در سلول‌هاي ايمني مي باشند، انجام نشده است. اكتشافات اين تحقيق، همراه با ساير اطلاعات آزمايشگاه ما، نشان مي‌دهد كه ترومبوسيت‌ها مي‌توانند TLR آزاد كنند كه باعث مي‌شود ترومبوسيت‌ها به عنوان سلول‌هاي موثر اوليه شناخته شوند. 
    ترومبوسيت‌ها فراوان‌ترين سلول‌هاي سفيد خون در خون ماكيان مي‌باشند و در جريان آنها مقدار ترومبوسيت‌ها 6 برابر بيشتر از تعداد هتروفيل‌ها مي‌باشد. اين موضوع نشان مي‌دهد كه اگرچه ترومبوسيت‌ها و هتروفيل‌ها داراي عمكرد سلول‌هاي موثر مشابهي در مقابله ميزبان ذاتي با آلودگي‌هاي باكتريايي هستند، ترومبوسيت‌ها با تعداد محدود مي‌توانند سلولهاي موثر اوليه جوجه‌ها باشند.
 
منبع :ماهنامه دام کشت و صنعت، شماره 124
 
 

نوشته شده در 05/10/1392 پنجشنبه ساعت 10:50:11 توسط مهندس احمد یزدانی


بازگشت به صفحه طیور


امتیاز شما به این مطلب

در کادر زیر نظر خود را درج نمایید




 refresh
کد امنیتی را وارد نمایید
روش فعالیت در انجمن کشاورزی


مشاوره خصوصی

بهشت

طراحی سازه های کشاورزی بر مبنای مکانیزم شاز که در کره ماه برای اولین بار انجام پذیرفته می تواند پرشی بسوی کشاورزی و تولید خاک مرغوب از بهشت برین باشد.

 


شرکت بساک