کاربرد کشت سوسپانسیون سلولی در گیاهان داروئی
کاربرد کشت سوسپانسیون سلولی در گیاهان داروئی

 کاربرد کشت سوسپانسیون سلولی در گیاهان داروئی

گیاهان داروئی به واسطه دارا بودن ترکیبات شیمیائی و متابولیتهای ثانویه با ارزش، از سالیان دراز به عنوان منبع ارزشمندی برای درمان و سایر کاربردهای پزشکی مورد استفاده قرار گرفته و هم اکنون حجم وسیعی از داروها دارای منشاء گیاهی هستند. با توجه به مقدار نسبتاً کم این ترکیبات در گیاهان داروئی، استفاده از تکنیکهای ویژه‌ از جمله کشت بافت برای افزایش تولید روز به روز در حال افزایش است. تکنیک کشت سوسپانسیون سلولی یکی از موثرترین و پرکاربردترین روشها برای افزایش تولید متابولیتهای ثانویه است. در تعداد زیادی از گیاهان داروئی این روش بهینه شده و امروزه نیز با استفاده از بیورآکتورها توانسته‌اند حجم تولید را به مقدار قابل توجه‌ای افزایش دهند. با توجه به رشد چشمگیر و افزایش در تمایل در مصرف داروهای گیاهی و ترکیبات موثره آنها، به نظر می‌رسد که تکنیک کشت سوسپانسیون سلولی به عنوان یکی از چشم‌اندازهای آینده در صنعت گیاهان داروئی به حساب خواهد آمد.
مقدمه
قرنهاست که انسان به گیاهان به عنوان منبع کربوهیدرات، پروتئینها و چربیها برای تامین غذا و داشتن سرپناه وابسته است (21). علاوه‌براین گیاهان منبع سرشاری از طیف وسیعی از متابولیتهای ثانویه هستند که در درمان بیماریها، طعم‌دهنده‌ها، رنگها، آفت‌کشها و چاشنیها مورد استفاده قرار می‌گیرند (15-21). بیش از 80 درصد از 30000 ترکیب طبیعی شناخته شده، منشا گیاهی دارند که بیشتر از ترکیبات شناخته شده میکروبی است. به طور مثال در سال 1980 میلادی بیش از 3500 ترکیب شیمیائی مورد شناسائی قرار گرفته که حدود 2600 مورد از آنها از گیاهان به دست آمده بودند. پیشرفتهای صورت گرفته در شناسائی ترکیبات شیمیائی و روشهای آزمایشگاهی، سبب سرعت بخشیدن به کشف ترکیبات موجود در گیاهان شده است (20). در سالهای نخست قرن 21 اهمیت گیاهان داروئی از جنبه اقتصادی و داروئی بیش از پیش پی برده شد به طوریکه براساس آمارهای به دست آمده، از سال 1981 تا سال 2002 میلادی، 28 درصد از کل 868 داروی جدید تولید شده، منشاء گیاهی داشته‌اند و همچنین حدود 60 درصد داروهای ضد سرطان و 75 درصد داروهای بیماریهای مسری موجود در بازار نیز به طور مستقیم یا غیر مستقیم از گیاهان به دست آمده‌اند (2-13).
 
دستیابی به ترکیبات داروئی گیاهان در طبیعت یا گیاهان کشت شده، بسیار محدود بوده و با مشکلات فراوانی همراه است. گیاهان داروئی به سختی کشت و کار می‌شوند و مسائل اکولوژیکی و سیاسی نیز در این زمینه وجود دارند. به همین منظور برای فائق آمدن بر این مشکلات، تلاشهای فراوانی در طول دهه‌های اخیر برای تولید ترکیبات داروئی در محیط مصنوعی به وسیله روشهای بیوتکنولوژی از سلولهای گیاهی صورت گرفته است (2).
 
 تکنیکها و روشهای بیوتکنولوژی، خصوصاً کشت بافت، نقش بسیار ارزنده‌ای در تولید ترکیبات شیمیائی مفید گیاهان در شرایط آزمایشگاهی داشته‌اند. توانائی و ظرفیت کشت اندام، بافت و سلول گیاهی برای ایجاد و انباشت بسیاری از ترکیبات شیمیائی با ارزش، سرآغاز دانش نوینی برای تولید این ترکیبات در شرایط مصنوعی شده است (11-15).
 
 
 
کشت بافت و تولید متابولیتهای ثانویه
 
گیاهان منبع عظیمی از ترکیبات شیمیائی مفید هستند که انسان از روشهای مختلف و در جهات گوناگون از این ترکیبات استفاده می‌کند. بسیاری از این ترکیبات فعال، می‌توانند در گروه متابولیتهای ثانویه قرار گیرند که گیاهان در هنگام مواجهه با شرایط نامساعد و غیر طبیعی تولید می‌کنند و عملاً برای رشد عادی و تولید مثل گیاه ضرورت ندارند. متابولیتهای ثانویه دسته بزرگی از ترکیبات فوق‌العاده و مولکولهای پیچیده هستند که از طریق مسیرهای بیولوژیکی متفاوت تولید می‌شوند و غالباً فعالیت دفاعی گیاه را در مقابله با تنشهای زیستی و غیر زیستی بهبود می‌بخشند. و همین موضوع سبب گردیده که موثر بودن این ترکیبات در درمان بیماریهای انسانی نیز کاربرد داشته باشد و سالهاست که در طب سنتی از آنها برای درمان بسیاری از بیماریها استفاده می‌گردد. بسیاری از متابولیتهای ثانویه در مقادیر بسیار اندکی به طور طبیعی در گیاهان وجود دارند که میزان آن حدود 1 درصد از کل میزان کربن گیاه است (12).
 
این ترکیبات در گیاهان به طور طبیعی تولید می‌گردند ولی پیشرفتهای کشت بافت در تولید متابولیتهای ثانویه بسیار فراوان بوده و هر روز به آنها افزوده می‌شود. تولید این ترکیبات در شرایط مصنوعی توسط کشت بافت دارای مزیتهای فراوانی است که می‌توان به موارد زیر اشاره نمود(8-11-15-21):
 
ü                       تولید مطمئن، ساده‌تر و بسیار قابل پیش‌بینی
 
ü                       جداسازی موثر، سریع و با صرفه‌
 
ü                       تولید بالای همزمان ترکیب مورد نظر در کل گیاه
 
ü                       قابلیت استاندارسازی استفاده از الیسیتورها در تولید متابولیتهای ثانویه
 
ü                       قابلیت ردیابی متابولیتهای ثانویه با استفاده از برچسب‌زنی مواد رادیواکتیو و غیر رادیواکتیو
 
ü                       تولید خارج از فصل و عدم تاثیر شرایط محیطی
 
ü                       تغییر مسیر بیوسنتزی متابولیت ثانویه
 
  فناوری کشت سوسپانسیون سلولی
 
کشت سلول گیاهی یکی از مهمترین ابزارهای پایه در مطالعات بیوتکنولوزی و بیولوژی سلولی می‌باشد (16). کشت سوسپانسیون سلولی، شامل توده‌های سلولی پراکنده و در حال رشد در محیط کشت مایع و در حال حرکت است. این کشتها معمولاً با انتقال قطعاتی از کالوس ترد و تمایز نیافته به محیط کشت مایع که بطور یکنواخت و مداوم تکان داده می‌شود، شروع می‌شوند. پس از تولید بافت کالوس، به منظور تولید مقدار ملاحظه‌ای از این بافت، آنرا از ریزنمونه مادری جدا نموده و به محیط کشت جدیدی انتقال می‌دهند. این کالوس به محیط کشت مایع انتقال یافته و تکان داده می‌شود تا سوسپانسیون سلولی خوبی ایجاد شود (8-16).
 
 موفقیت در ایجاد کشت سوسپانسیون به کالوس اولیه بستگی دارد. استفاده از ریزنمونه‌های متنوع و محیط کشتهای مختلف برای القا کالوس، موفقیت‌آمیز بوده است. سرعت رشد و تردی کالوس تولید شده بسته به نوع ریزنمونه می‌تواند متفاوت باشد. محیط کشت مورد استفاده برای کشت سوسپانسیون بایستی به نحوی باشد که رشد خوب کالوس را تضمین نماید (8-16). فناوری کشت سوسپانسیون سلولی دارای مزایای فراوانی است که از مهمترین آنها می‌توان به موارد زیر اشاره کرد (15-28):
 
ا- نسبت بالای تکثیر سلولها نسبت به سایر روشها           2- کنترل مناسب شرایط محیطی          3- شناسائی سریع و موثر ترکیبات موجود در بافتهای گیاهی     4- تولید بالای متابولیتهای ثانویه        5- ایجاد گیاهان تراریخت با خصوصیات ویژه        6- نگهداری گیاهان در شرایط کنترل شده و باززائی آنها
 
       
 
انواع کشت سوسپانسیونی
 
 الف- کشت بسته Batch culture
 
کشت بسته نوعی کشت سوسپانسیون سلولی است که سلولها در حجم ثابتی از محیط کشت رشد می‌نماید. با تقسیم و رشد سلولها، بیوماس سلولی افزایش می‌یابد تا جائی که یکی از فاکتورهای محیط کشت مانند اکسیزن یا مواد غذائی کم شده و رشد متوقف گردد. سلولهای کشت سوسپانسیونی پنج مرحه خفته (Lag phase)، مرحله تصاعدی (Exponential phase)، مرحله خطی (Linear phase)، مرحله کند شدن (Deceleration phase) و مرحله سکون (Stationary phase) را در چرخه رشد طی می‌کند. مرحله خفته زمانی است که سلولها به محیط کشت تازه منتقل می‌شوند و تقسیم سلولی صورت نمی‌گیرد. در این مرحله ممکن است متابولیتهای خاصی در سلولها تولید شوند و یا سرعت یک فعالیت فیزیولوژیکی در آنها افزایش یابد. هدف کلی در کشتهای سوسپانسیون سلولی، دست یافتن به سرعت رشد سریع و سلولهای یکنواخت است که زیر کشتهای مکرر در محیط غذائی مناسب این خصوصیات را تضمین می‌کند. (8).
 
 
 
ب- کشت پیوسته (Continuous culture)
 
کشتی است که به طور مداوم با تزریق محیط غذائی تازه تغذیه می‌شود اما حجم کشت معمولاً ثابت نگه داشته می‌شود. این کشت خود بر دو نوع کشت پیوسته باز و کشت پیوسته بسته است. کشت پیوسته باز نوعی سیستم پیوسته است که در آن جریان ورودی محیط کشت تازه با جریان خروجی متناظر که برداشت سلولها را در بر دارد متعادل می‌شود. سلولها بطور ثابت با جریان خروجی مایع به بیرون شسته می‌شوند. میزان ورودی محیط کشت و میزان برداشت به نحوی تنظیم می‌گردد که سرعت رشد نزدیک به حداکثر، بطور مداوم و ثابت در کشتها حفظ شود. در کشت پیوسته بسته جریان ورودی محیط کشت تازه با جریان خروجی محیط کشت استفاده شده، متعادل می‌شود. سلولها بطور مکانیکی از محیط کشت خروجی جدا شده و دوباره به محیط کشت برگردانده می‌شوند بنابراین جمعیت سلولی با تداوم رشد افزایش می‌یابد (8).
 
 
 
ج- کشت نیمه پیوسته (Semi continuous culture)
 
در این کشت، جریان محیط کشت تازه بطور دستی طی یک فرایند تخلیه و پر کردن با فواصل زمانی زیاد کنترل می‌گردد و همواره میزان خروج و ورود محیط کشت برابر است. در این نوع کشت، اگرچه تعداد سلولها بطور تصاعدی افزایش می‌یابد، اما با جایگزینی متناوب محیط کشت برداشت شده با محیط کشت تازه، تراکم سلولها در محدوده ثابتی نگه داشته می‌شود (8).
 
 
 
کاربردهای کشت سوسپانسیون                                         
 
کشت سلولی سوسپانسیون کاربردهای فراوانی در علوم گیاهی مختلف خصوصاً اصلاح‌نباتات دارد. با استفاده از سوسپانسیون سلولی جنین‌زا، می‌توان به تکثیر گیاهان مشابه بطور گسترده پرداخت. جنین‌ها اندامهای طبیعی بقاء هر گیاه هستند که بسیاری از آنها به صورت نهفته در می‌آیند و به خاطر نهفتگی ذاتی، جنین‌های سوماتیکی حاصل از سوسپانسیونهای سلولی برای ذخیره طولانی مدت در بانکهای ژرم‌پلاسم بسیار مفیدند. از کشتهای سوسپانسیون جنین‌زا می‌توان در مطالعات نظری و تحقیقات عملی استفاده نمود و برای انتخاب مناسبترین فرد در سطح سلولی و تحت تنشهای زنده و غیر زنده سود جست. علاوه‌براین کشتهای سلولی منبع با ارزشی برای تولید مواد شیمیائی محسوب می‌شوند (8-15).
 
 
 
تولید متابولیتهای ثانویه از طریق کشت سوسپانسیون
 
از کشت سوسپانسیون سلولهای گیاهی می‌توان برای مطالعه بیوسنتز متابولیتهای ثانویه استفاده نمود. اگر سلولهای گیاهی تحت شرایطی کشت شوند که امکان تمایز تا حد مشخصی برای آنها وجود داشته باشد، پتانسیل تولید طیف گسترده‌ای از فرآورده‌های ثانویه را به خودی خود و یا با بیوترانسفورماسیون پیش ماده‌های خاص، دارا می‌باشند (8-15).
 
تولید متابولیتها با استفاده از تکنیک کشت سلولی علاوه‌بر تکرار پذیری بالا، از نظر زیست محیطی نیز بسیار مناسب است و عملاً تهدیدی برعلیه منابع طبیعی نخواهد داشت. یکی از مهمترین مثالهای موفق در ساخت متابولیتها، تولید paclitaxel در گیاه Taxus spp است که مهمترین ماده ضد سرطان در پزشکی محسوب می‌گردد. مطالعات تولید paclitaxel از دهه 1980 میلادی آغاز گردید. در حالت طبیعی برای تولید 300 گرم paclitaxel بایستی درختی با سن 100 سال را مورد استفاده قرار داد و این در حالی است که استفاده از کشت بافت توانسته است بهبود قابل توجهی در عملکرد تولید آن ایجاد کند (12).
 
کشت سلولی می‌تواند از هر نوع ریز نمونه‌ای (explant) مانند ساقه، ریشه، برگ، جنین یا گره ساقه آغاز گردد. این ریز نمونه می‌تواند بر روی محیط جامد به کالوس تبدیل شده و سپس برای تولید میزان بیشتری از این توده سلولی، به محیط کشت مایع یا جامد دیگری برده شود. سلول‌های از تمایز خارج شده کالوس می‌توانند با استفاده از القاء به صورت هر نوع سلول سوماتیکی تمایز یافته‌ای تبدیل شوند (12).
 
کشت سلول گیاهی منبع جایگزینی به جای استفاده از کل گیاه برای تولید متابولیتهای ثانویه است. سلولهای گیاهی با دارا بودن خاصیت توتی‌پوتانسی می‌توانند همانند یک گیاه بالغ طیف گسترده‌ای از ترکیبات شیمیائی را تولید کنند.  اولین و مهمترین چالش تولید متابولیتها با استفاده از تکنیک کشت سلول، عملکرد پائین و تجمع کم متابولیتها در سلولهای از تمایز خارج شده است. برای رفع این چالش راه‌کارهای متعددی پیشنهاد گردیده است (12).
 
 
 
استراتژیهای بهبود عملکرد متابولیتهای ثانویه در کشت سلول
 
در طول دهه گذشته پیشرفتهای قابل ملاحظه‌ای در جهت افزایش تولید و انباشت متابولیتهای ثانویه توسط کشت سلول در گیاهان به دست آمده است. تولید مقادیر بالای شیکونین در کشت سلول گیاه Lithospermum erythrorhizon، بربرین در گیاه Coptis japonica و سانگوینارین از گیاه Papaver somniferum از جمله مثالهای موفق در این زمینه هستند (21).
 
تاکنون راه‌کارهای متفاوتی برای افزایش تولید و عملکرد متابولیتها در کشت بافت ارائه شده است که می‌توان به تغییر ترکیبات محیط کشت و انتخاب کلونی اشاره کرد (12). تغییر در ترکیب مواد مغذی محیط کشت تولید، اثرات قابل توجهی بر سنتز متابولیتهای ثانویه ایجاد می‌نماید. ساکارز عموماً به عنوان منبع کربن و انرژی استفاده می‌گردد و منجر به میزان رشد مطلوبی در کشتهای سلولی گیاهی می‌شود با این حال از مانوز، گالاکتوز، گلوکز و رافینوز نیز بجای ساکارز نیز استفاده می‌شود. ماهیت و غلظت قند مورد استفاده، عملکرد محصولات ثانویه را متاثر می‌سازد. نوع و غلظت مواد هورمونی احتمالاً یکی از مهمترین عوامل موثر بر سنتز متابولیتهای ثانویه توسط سلولهای کشت سوسپانسیونی است و برای تاثیر مطلوب سنتز فراورده‌های ثانویه، گسترده‌ای از ترکیبات و غلظت‌های مختلف هورمونی بایستی مورد بررسی قرار گیرد (8).
 
افزودن مواد پیش‌ساز از منبع خارجی به محیط کشت ممکن است تولید نهائی فراورده را افزایش دهد، اما افزودن یک ماده پیش‌ساز مشخص، همیشه اثر مطلوب مورد نظر را در پی ندارد. در تعدادی از کشتهای سلولی مشخص گردیده که شرایط محیطی بویژه نور تولید متابولیتهای ثانویه را تحریک می‌کند. به عنوان مثال، ترکیباتی نظیر کارتنوئیدها، فلاونوئیدها، پلی‌فنلها و پلاستوکینونها در اثر نور تحریک می‌شوند از طرفی بیوسنتز برخی از متابولیتها تحت تاثیر نور قرار نمی‌گیرد و حتی ممکن است توسط نور ممانعت شود. نور سفید یا آبی تقریباً بطور کامل مانع بیوسنتز آلکالوئیدها می‌شود (8).
 
 
 
الف- غربال و انتخاب لاینهای سلولی با عملکرد بالا
 
بهبود یک سویه، با انتخاب والدینی که دارای عملکرد بالائی از نظر متابولیت ثانویه هستند آغاز می‌گردد. به همین دلیل بایستی غربال در یک جمعیت هتروژن صورت گیرد تا کلونهائی با بیشترین عملکرد به دست آید. انتخاب بهترین کلون می‌تواند در رابطه با متابولیتهائی که رنگ خاصی دارند آسان است. بطور مثال در کشت سلولی گیاه L. erythrorhizon، با استفاده از غربال توانسته‌اند کلونهائی با 10 تا 12 برابر شیکونین به دست آورند. راه‌کارهای موتاسیونی نیز می‌توانند در انتخاب لاینهای پر عملکرد موثر باشند. همچنین استفاده از عناصر انتخابگر نیز کاربرد بالائی در زمینه انتخاب و غربال لاینها دارند. در این روش جمعیت هتروژن با عملکرد بالا  را تحت تاثیر یک عامل بیرونی نظیر توکسین قرار داده و لاین‌های مورد نظر را انتخاب و تکثیر می‌کنند (8-15-21).
 
در گزینش لاینهای سلولی خاصی که مقادیر فراوانی از یک متابولیت مفید را تولید نمایند، دو روش کلی کلون کردن تک سلول و کلون کردن توده سلولی استفاده می‌شود. کلون کردن تک سلول بسیار وقت گیر بوده و با مشکلات فراوانی روبروست ولی کلون کردن توده سلولی که نوعی روش کشت بافت است، راحتر بوده و از تنوع ژنتیکی سلولها در تولید یک ترکیب شیمیائی که در جمعیت سلولها وجود دارد، بهره می‌گیرد (8).
 
 
 
ب- تغییر مواد غذائی محیط کشت
 
تغییر و دستکاری محیط کشت در افزایش تولید و انباشت متابولیتهای ثانویه موثر است. افزایش بیان بسیاری از متابولیتهای ثانویه در مسیرهای بیوسنتزی خود به آسانی با تغییر مواد معدنی موجود در محیط کشت، عوامل استرسزا، نور و تنظیم کننده‌های رشد امکان‌پذیر است. عناصر تشکیل دهنده محیط کشت سلولی عامل اصلی تعیین کننده رشد و انباشت متابولیتهای ثانویه هستند (15-21-23).
 
 
 
1- سطوح مختلف قند
 
کشتهای سلولی گیاه معمولاً هتروترف بوده و از یک قند ساده به عنوان منبع کربن استفاده می‌کنند. مشخص شده است که سطوح مختلف ساکارز بر تولید و انباشت متابولیتهای ثانویه موثر است. به طور مثال غلظت 5/2 و 5/7 درصد ساکارز در کشت سلولی گیاه Coleus blumei به ترتیب سبب افزایش 8/0 تا 3/3 گرم در لیتر میزان رزماریک اسید گردیده است (21-23).
 
 
 
2- سطوح نیتروژن و فسفر
 
غلظت نیتروزن بر روی میزان تولید اسید آمینه در کشتهای سوسپانسیون موثر است. در بسیاری از محیطهای کشت از هر دو منبع نیتروژن یعنی نیترات و آمونیوم استفاده می‌شود. به همین دلیل نسبت آمونیوم به نیترات عامل مهمی در تولید متابولیتهای ثانویه محسوب می‌گردد. به طور مثال کاهش سطح آمونیوم و افزایش مقدار نیترات سبب افزایش شیکونین و بتاسیانین می‌گردد و اگر نسبت آمونیوم به نیترات افزایش یابد تولید بربرین و ابیکوئینین افزایش می‌یابد. غلظت فسفات در محیط کشت می‌تواند اثر قوی بر روی تولید متابولیتهای ثانویه در کشت سلولی داشته باشد. سطوح بالای فسفر سبب افزایش رشد سلول می‌گردد ولی بر روی انباشت متابولیتها نقش منفی خواهد داشت (21).
 
 
 
3- تنظیم کننده‌های رشد
 
غلظت تنظیم کننده‌های رشد اغلب فاکتور بسیار مهمی در انباشت و تولید متابولیتهای ثانویه است. نوع و غلظت اکسین و سیتوکینین یا نسبت اکسین به سیتوکینین بر روی میزان رشد و تولید کشت سلولهای گیاهی موثر می‌باشد. به طور مثال هورمون توفوردی که نوعی اکسین قوی است نقش ممانعت کننده در تولید متابولیتهای ثانویه دارد ولی مصرف سیتوکینین بستگی به نوع متابولیت مربوطه و گونه گیاهی دارد. در رابطه با جیبرلیک اسید و آبسیزیک اسید مشاهده می‌شود که مصرف آنها سبب جلوگیری از تولید آنتوسیانین در بسیاری از کشتهای سلولی می‌گردد (20-22).
 
 
 
ج- اپتیمم کردن محیط کشت
 
شرایط محیطی کشت مانند نور، دما، اسیدیته و میزان اکسیژن در بسیاری از کشتهای سلولی نقش مهمی در تولید و انباشت متابولیتهای ثانویه دارند.  دمای معمولی که در کشت سلول استفاده می‌گردد در حدود 17 تا 25 درجه سانتیگراد است با این حال هر گونه گیاهی ممکن است به دمای خاصی نیازمند باشد. به طور معمول کاهش دمای کشت سبب افزایش میزان کل اسیدهای چرب در سلولهای کشت شده می‌شود (21).
 
 
 
د- الیسیتشن
 
شاید مهمترین راه‌کار برای افزایش و بهبود میزان متابولیتها در کشت سلول گیاهی، استفاده از الیسیتشن باشد. یک الیسیتور را می‌توان ترکیبی دانست که سبب افزایش بیان ژنهای مسیر بیوسنتز تولید یک متابولیت می‌گردد. الیسیتورها شامل هورمونهای طبیعی، مواد غذائی و ترکیبات شیمیائی با منشا قارچ یا باکتری هستند. از مهمترین الیسیتورها می‌توان به جاسمونیک اسید و متیل جاسمونات اشاره کرد که هر دو در تنظیم ژنهای موجود در سیستم دفاعی و سیگنال‌دهی نقش بسیار فعالی دارند (12-15).
 
مکانیسم تولید متابولیتهای ثانویه در طبیعت به صورت واکنش به استرسها محیطی زنده و غیر زنده است. الیسیتورها سیگنالهای رها شده‌ای برای تولید متابولیتهای ثانویه بوده و مسیرهای بیوسنتز متابولیتهای ثانویه در مواجه با استرس فعال می‌شوند. الیسیتورهای زیستی و غیر زیستی مختلفی برای افزایش تولید متابولیتها در کشت سلول گیاهی استفاده می‌شوند. بطور مثال کشت سوسپانسیون سلولی گیاه شقایق (P. somniferum) با استفاده از میسیلیوم‌های قارچ Botrytis mycelium سبب افزایش تولید سانگوینارین به میزان 3 درصد گردیده است و در کشت سوسپانسیون داتوره نیز استفاده از مس و کادمیوم سبب افزایش تولید و تجمع سسکوئی‌ترپنها شده است (21). الیسیتورهای مختلف ممکن است مسیرهای بیوسنتزی مختلفی را مورد هدف قرار دهند. طور مثال متیل جاسمونات و سالسیلیک اسید در گیاه Taxus spp از مسیرهای مختلفی سبب افزایش عملکرد paclitaxel می‌شوند (12-21).
 
 
 
ه- خارج کردن متابولیتها از محیط کشت
 
انباشت کم متابولیتهای ثانویه در کشت سلولی در بسیاری از موارد به علت کمبود آنزیمهای مهم بیوسنتز این متابولیتهاست اما در برخی موارد به دلیل اثر بازدارندگی غلظت متابولیتهای آزاد شده موجود در محیط کشت، بیوسنتز یک متابولیت خاص کاهش یافته و یا متوقف می‌شود. در چنین مواردی بایستی مواد تولید شده توسط یک فاز دیگر به خارج از محیط کشت منتقل شوند (21). به طور مثال یکی از مشکلات عمده در تولید بنزیل ایزوکوینولین آلکالوئیدها توسط کشت سلولی جداسازی این ترکیبات از محیط کشت است (23).
 
ایموبایلیزشن (غیر متحرک‌سازی) کشت سلولی و تولید متابولیتهای ثانویه
 
ایموبایلیزشن کشت سلول گیاهی سبب افزایش انباشت متابولیتها می‌گردد که به آسانی می‌تواند توسط ماتریکس ژلی مانند alginate میسر شود (12). بهبود تولید متابولیتهای ثانویه کشت سلولی گاهی اوقات با سازماندهی و تمایز سلولهای گیاهی همراه است و همین موضوع سبب استفاده از تکنیک ایموبایلیزشن گردیده است. اساس این تکنیک به صورت محبوس نمودن یک آنزیم کاتالیتیکی فعال یا سلولها بر روی یک محیط ثابت شده و جلوگیری از ورود آن به محیط مایع است که در اثر آن سلولهای گیاهی ایموبایلیزه شده به سمت مسیرهای بیوسنتز  جدید متابولیتهای ثانویه سوق داده می‌شوند. تکنیکی که به طور گسترده‌ برای ایموبایلیزشن و به دام انداختن سلولهای گیاهی استفاده می‌گردد، استفاده از نوع خاصی ژل یا ترکیب چند نوع ژل است که اجازه پلیمریزه شدن در اطراف آنها را می‌دهد (21). برای محبوس ساختن سلولهای گیاهی و نهایتاً غیر متحرک کردن آنها، پلیمرهای مختلفی از جمله پلی‌آکریلامید، اپوکسی‌رزین، پلی‌اورتان، سلولز، آگار و آگارز، کاپا کاراژینان، آلژینات، سیتوزان، کلاژن، ژلاتین و فیبرین وجود دارند. غالبا از آگارز یا آلژینات برای محبوس کردن سلولهای گیاهی استفاده می‌گردد. روش دیگری نیز وجود دارد که شامل محبوس ساختن سلولها درون فضاهای یک ماتریکس، مانند نایلون یا پلی اورتان است. این مواد را معمولاً به صورت کره یا مکعبهائی با قطر 1 سانتیمتر می‌سازند (8).
 
 
 
بیوترانسفورماسیون
 
یکی از زمینه‌های بیوتکنولوزی که در سالهای اخیر بسیار مورد توجه قرار گرفته است، توانائی کشتهای سلولی گیاهان در بیوترانسفورماسیون یک ماده پیش‌ساز کم اهمیت به یک فراورده نهائی ارزشمندتر است. تغییر در ساختار و یا ترکیب بخش کوچکی از مولکول و تبدیل آن به مواد شیمیائی صنعتی مهم با استفاده از سیستمهای بیولوژیکی را بیوترانسفورماسیون گویند (8-23).
 
استفاده از کشتهای سلولهای گیاهی در بیوترانسفورماسیون مواد، مستلزم گزینش آن دسته از سلولهای گیاهی است که قابلیت‌های آنزیمی کاتالیز واکنش ویژه مورد نظر را دارا باشند. از طرفی عامل مهم دیگری نیز در این گزینش نقش دارد که اختصاصی بودن واکنش آنزیمی می‌باشد. بیوترانسفورماسیون با استفاده از سلولهای گیاهی از دو ویژگی بسیار مطلوب توانائی انجام بیش از یک واکنش و استفاده از کشتهای سلولی غیر مولد را برای سنتز فراورده نهائی مورد نظر برخوردار هستند (8).
 
 
 
بیوراکتورها و افزایش تولید متابولیتهای ثانویه در کشت سلولی
 
اخیراً استفاده از بیوراکترها برای افزایش تولید متابولیتهای ثانویه در کشت سلول گیاهی کاربرد فراوانی پیدا کرده است. در بیوراکتورها سلولهای گیاهی در کشت سوسپانسیون در شرایط یکسان از نظر خصوصیات شیمیائی و محیطی قرار می‌گیرد(7-11). کشت سلول گیاهی همواره از نظر میزان تولید از پایداری کمی برخوردار می‌باشد و از نظر میزان اکسیژن و مواد غذائی در دسترس، حساسیت بالائی را نشان می‌دهد. به همین دلیل استفاده از بیوراکتورها به منظور دستیابی سلولها به مواد غذائی مناسب و اکسیژن کافی، یکی از راه‌های رفع این مشکل در کشت سلولی است. (21).

نوشته شده در 05/12/1395 پنجشنبه ساعت 23:31:10 توسط samira


بازگشت به صفحه ژنتیک و اصلاح نباتات


امتیاز شما به این مطلب

در کادر زیر نظر خود را درج نمایید




 refresh
کد امنیتی را وارد نمایید